Nach seinem Tod in Batman: Arkham City wurde der Leichnam des Jokers eingeäschert. Neun Monate später, es ist Halloween, wird ein Restaurant in Gotham Schauplatz eines Alptraumgas-Angriffs durch Dr. Jonathan Crane, der als Scarecrow sein Unwesen treibt. Dieser droht, sein Gas mittels einer speziellen Vorrichtung über die ganze Stadt zu verteilen. Daraufhin werden die sechs Millionen Einwohner aus der Stadt evakuiert, übrig bleiben nur die marodierenden und plündernden Verbrecher mit ihren Anführern, einige Polizisten des Gotham City Police Department unter der Leitung von Commissioner James „Jim“ Gordon sowie Batman und seine Verbündeten.
Mit Hilfe von Barbara Gordon, die unter dem Decknamen Oracle für Batman arbeitet, und der technischen Ausrüstung des Batmobils kann Batman Scarecrow und seine Maschine in der Fabrik von ACE Chemicals ausmachen. Als Batman die Fabrik stürmen will, stellt sich ihm ein unbekannter Krieger in einer hochmodernen Rüstung entgegen, der Arkham Knight. Dieser verfügt nicht nur über detailliertes Wissen über Batmans Ausrüstung und Kampftechniken, sondern auch über eine eigene Armee aus hunderten Soldaten, unbemannten Kampfpanzern und Flugdrohnen. Diese Miliz rückt kurz darauf aus und bringt Gotham City gewaltsam unter ihre Kontrolle.
Nachdem Batman Geiseln gerettet hat, die bei ACE Chemicals festgehalten wurden, kann er Scarecrow in der werkseigenen Mischkammer stellen. Dieser entkommt jedoch, während die Explosion, die das tödliche Angstgas über die ganze Ostküste verteilen würde, kurz bevorsteht. Batman kann den Radius des Fallouts auf ein Minimum reduzieren und aus der explodierenden Fabrik entkommen. In Rückblenden erfährt man, dass das in Batman: Arkham City verteilte, mit „Titan“ verunreinigte Blut des Jokers mehreren Personen verabreicht wurde, die nun stetig mehr die Eigenschaften des Clownprinz des Verbrechens aufweisen. Batman konnte besagte Opfer in einem Versteck in den Panessa Filmstudios isolieren, doch er selbst wurde ebenfalls infiziert und wird von nun an von einer stets präsenten Halluzination des Jokers begleitet, der beginnt seine Taten zu hinterfragen und sein Bewusstsein für die Umwelt immer weiter manipuliert, sodass Batman zwischen Realität und Halluzination nicht mehr unterscheiden kann.

DLC Episoden

• Catwoman’s Revenge (Riddler)

• Robin: A Flip of a Coin (Two-Face)

• Red Hood Story Pack (Black Mask)

• Nightwing: GCPD Lockdown (Pinguin)

• Harley Quinn Story Pack (Poison Ivy)

• Batgirl: A Matter of Family (Joker)

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